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Q&A 质粒提取常见问题分析

发表于:2010-11-18 14:46:58    点击率:4416

 在质粒提取过程中,最常出现问题的主要是裂解步骤,应小心操作。下面列出几种常见问题及可能原因:

q 未提出质粒或质粒得率较低

  a-1 大肠杆菌老化

      ——一般甘油保存菌株,需先活化。

      ——请涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体种子培养,取种液1/1000接种,正式培养。

  a-2 质粒拷贝数低

      ——由于使用低拷贝数载体引起的质粒dna提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

  a-3 菌体中无质粒

      ——有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

      ——摇菌时间过长造成的菌种死亡,如含puc18的大肠杆菌摇菌时间不超过14h

  a-4 碱裂解不充分

      ——使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液p1p2p3的用量。对低拷贝数质粒,如果菌体量超过5ml,提取时应加倍使用溶液p1p2p3,有助于增加质粒提取量和质粒质量。

  a-5 溶液使用不当

      ——溶液p2p3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶液清亮,才能使用。

  a-6 吸附柱过载

      ——不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如tb2×yt,菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率,则需调整lb培养液体积。

  a-7 质粒未全部溶解

      ——洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。

  a-8 乙醇残留

      ——漂洗液洗涤后可用延长离心时间的方法尽量去除残留液体,再加入洗脱缓冲液。

  a-9 洗脱液加入位置不正确

      ——洗脱液应加在硅胶膜中心部位,以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面,使洗脱效率达到最大。

  a-10 洗脱液不合适

      ——dna只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液eb/tb10mm tris·cl,ph8.5)或水。洗脱效率取决于ph值。最大洗脱效率在ph7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其ph值在些范围内,如果ph过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

  a-11 洗脱体积太小

      ——洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但质粒浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

  a-12 裂解时间过长

      ——加入溶液p2后裂解时间不应超过5分钟。

  a-13 洗脱时间过短

      ——洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置2分钟再离心,可达到较好的效果。

 

q 质粒纯度不高

  a-1 混有蛋白

      ——不要使用过多菌体。溶液p1p2p3处理并离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物,可再次离心去除后再进行下一步骤。

  a-2 混有rna

      ——减少菌体用量或加入溶液p3之后室温放置一段时间。如果已加入rnase a的溶液p1已保存6个月以上,请在溶液p1中重新添加rnase a

      ——对于大提试剂盒,严格控制异丙醇的加量。

  a-3 混有基因组dna

      ——加入溶液p2p3后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能把基因组dna剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液p2后过于粘稠,无法温和调匀,请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和dna的降解,不要超过16h

  a-4 p3溶液加入时间过长

      ——p3溶液加入后,放置时间不要太长,否则有可能会产生小片段dna污染。

  a-5 含大量核酸酶的宿主菌

      ——有些宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取过程中降解质粒dna,影响提取质粒dna的完整性,最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,如dh5top10

      ——使用去蛋白液pd,去除残留核酸酶。

  a-6 乙醇残留

      ——漂洗液洗涤后可用延长离心时间的方法尽量去除残留液体,再加入洗脱缓冲液。

  a-7 质粒的二聚体和多聚体形式

      ——是在质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可见,但不影响后续的酶切,转化,测序等实验。

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