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Q&A PCR常见问题分析

发表于:2010-12-1 9:20:08    点击率:6291

q 无扩增条带

   a-1 模板

       模板中含有杂蛋白、taq酶抑制剂等

       ——纯化dna模板,去除蛋白质或使用试剂盒提取模板dna

       模板核酸变性不彻底

       ——适当提高变性温度,延长变性时间。

       模板降解

       ——重新制备模板。

   a-2 引物

       引物合成质量不佳

       ——重新合成引物。

       引物降解

       ——高浓度小量分装保存,防止多次冻融,避免长期置于冰箱冷藏部分。

       引物设计不合理(如引物长度不够,引物之间形成二聚体等)

       ——重新设计引物(避免形成引物二聚体和二级结构)。

   a-3 mg2+浓度

       mg2+浓度偏低

       ——适当提高mg2+浓度:从1mm3mm,间隔0.5mm进行一系列反应,确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度。

   a-4 退火温度

       退火温度过高,影响引物与模板的结合

       ——降低退火温度,以2为梯度进行系列摸索。

   a-5 延伸时间

       延伸时间短

       ——增加延伸时间。

q 假阳性 现象:阴性样品出现的pcr扩增条带与目的靶序列条带一致。

   a-1 pcr污染

       靶序列或扩增产物的交叉污染

       ——操作时应小心轻柔,防止将含靶序列的样品吸入加样枪内或溅出离心管外;试剂或器材应高压灭菌,破坏存在的核酸,通过阴性对照实验确定污染是否存在。

       试剂污染

       ——各种试剂先进行分装,并低温贮存。

   a-2 引物

       引物设计不合适,选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性

       ——重新设计引物。

q 出现非特异性扩增

   现象:pcr扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者有时同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

   a-1 引物

       引物特异性差

       ——重新设计引物。

       引物浓度过高

       ——适当提高变性温度,延长变性时间。

   a-2 mg2+浓度

       mg2+浓度过高

       ——适当降低mg2+浓度:从1mm3mm,间隔0.5mm进行一系列反应,确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度。

   a-3 耐热聚合酶

       酶量过多

       ——以0.5u为间隔适当减少酶量。

   a-4 退火温度

       退火温度过低

       ——适当提高退火温度或采用二阶段温度法。

   a-5 pcr循环次数

       次数过多

       ——减少pcr循环次数。

q 出现片状拖带或涂抹带

   a-1 引物

       特异性差

       ——重新设计引物,改变引物的位置和长度,增强其特异性;进行巢式pcr

   a-2 模板dna

       模板不纯

       ——纯化模板或使用试剂盒提取dna

   a-3 mg2+浓度

       mg2+浓度过高

       ——适当降低mg2+浓度:从1mm3mm,间隔0.5mm进行一系列反应,确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度。

   a-4 dntp

       dntp浓度过高

       ——适当降低dntp浓度。

   a-5 退火温度

       退火温度过低

       ——适当提高退火温度。

   a-6 循环数

       循环数过多

       ——优化循环数。

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