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石蜡/冰冻切片免疫组化染色步骤

发表于:2007-6-6 10:53:06    点击率:2586

石蜡切片免疫组化染色步骤

1、载玻片的处理:

    抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常进行,可选用我公司提供的zli-9001 apeszli-9003 histogriptmzli-9005 poly-l-lysine等几种试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下:

1.1 apes现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的apes中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的apes,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。

1.2 histogriptm将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的histogrip液中,停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或60oc烤箱烘烤一小时,装盒备用。

1.3 poly-l-lysine将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡5分钟,60oc烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。

2、常用酶消化:

2.1 胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为37℃、10~40分钟,主要用于细胞内抗原的显示。

2.2 胃蛋白酶:一般使用浓度为0.4%,消化时间为37℃、30~180分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:laminin(层粘蛋白),collagen iviv型胶原)等。

2.3 皂素(saponin):一般使用浓度为2~10mg/mlsaponin溶液,消化时间为室温孵育30分钟。

3、抗原热修复:

可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液,如tbspbs、重金属盐溶液等,但实验证明,以0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)效果最好。请选用我公司提供的zli-9064 枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制,取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中,混匀,其ph值在6.0 ± 0.1,如因蒸馏水本身造成的ph值偏差,请自行调整。

3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3h2o2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92~98℃之间并持续10~15分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器,室温冷却10~20分钟(注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。pbs洗,下接免疫组化染色步骤。

3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后),计时1~2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,pbs2分钟×3,下接免疫组化染色步骤。

3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达92~98℃起开始计时15~20分钟,然后端离电炉,室温冷却20~30分钟,蒸馏水冲洗,pbs洗,下接免疫组化染色步骤。

4、免疫组化染色步骤:

(以美国zymed公司sp试剂盒为例)

4.1石蜡切片脱蜡至水。

4.2 3%h2o2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。

4.3蒸馏水冲洗,pbs浸泡5分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行)

4.4 5~10%正常山羊血清(pbs稀释)封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

4.5 pbs冲洗,5分钟×3次。

4.6滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%bsa-pbs稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。

4.7 pbs冲洗,5分钟×3次。

4.8滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(pbs稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。

4.9 pbs冲洗,5分钟×3次。

4.10显色剂显色(dabaec)。

4.11自来水充分冲洗,复染,封片。

 

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,pbs洗,5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。pbs洗,5分钟×2

 

下接免疫组化染色操作步骤。

(以美国zymed公司sp试剂盒为例)

4.1石蜡切片脱蜡至水。

4.2 3%h2o2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。

4.3蒸馏水冲洗,pbs浸泡5分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行)

4.4 5~10%正常山羊血清(pbs稀释)封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

4.5 pbs冲洗,5分钟×3次。

4.6滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%bsa-pbs稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。

4.7 pbs冲洗,5分钟×3次。

4.8滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(pbs稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。

4.9 pbs冲洗,5分钟×3次。

4.10显色剂显色(dabaec)。

4.11自来水充分冲洗,复染,封片。

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