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不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)

发表于:2007-6-6 10:53:53    点击率:4377

电转移和半干转,以及转膜的一些细节问题

续前:选好了膜,就该考虑如何做转膜了。经典的转膜方法是电转移,这个生物通在前面的westernblot仪器之选里面有提到过,因为电转移需要配套垂直电泳槽来进行。如何做这个“海绵—几层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海绵”的“三文治夹心”,在分子克隆上已经有详细的介绍,相信大家都很容易找到。一些细节:

  1. 记得全程手套操作,一则避免手印污染影响结果,二则保护自己(未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体,可不要这样白白为科学献身哈)

  2. 如果wb前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达,比如抗体少还要摸条件(稀释度),可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件,省点时间省点试剂;

  3. 去掉积层胶后,预染的marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面(预染marker如果照着说明书用量,有可能在电泳时看不到条带,但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量,或者多加1—2倍的量);如果目标蛋白小,指示剂也可以指示方向,但是如果蛋白大,指示剂已经跑出去了,就要留意分清胶上下方向,切个小角是常用的方法。膜上要做好标记,识别正反面和上下。剪一个小小角最方便。膜和滤纸一起裁最好(不过滤纸上下叠多了膜不好剪,硝纤膜容易裂,用利刀+尺子+垫厚报纸划比较容易)尽量和胶一样大小,胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm,保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。

  4. 对于特别小的蛋白,tricine sds-page电泳有助于提高蛋白大小在1kd—20kd间的分辨率,不用甘氨酸,丙烯酰胺的浓度也不用太高(可参考2004年中国生物工程杂志上有一篇文章(有效分离1kd小肽的tricine-sds-page方法),87年anal.biochem也有一篇文献)。

  5. 转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形,也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性,可以直接在胶上检测蛋白活性。

  6. 膜漂在水面(或者甲醇液面)让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气,膜彻底浸润后颜色会变深一点,任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志,会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理pvdf不要超过15秒。以后的步骤中不要让膜干涸了,万一不幸发生也用同样处理。

  7. 电转移缓冲液通常用tris glycine系统,如果是转膜后有部分样品要蛋白测序,最好用caps缓冲液,减少甘氨酸对测序的污染。

  8. 半干电转移(semi-dry)用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽,非常节约试剂,而且效果也好。由于不用“泡”在缓冲液中,半干转不单可用均一缓冲体系,也可以做非均一转移缓冲体系(配方下面有,还可以加 20 % (v/v) 甲醇,据说有助于增加转膜效率和减少胶变形的,但据说也有可能影响抗体识别)。半干转可以在30分钟内完成转膜(每平方厘米电流2.5—3.5ma,恒流,冷库。如果电流要求小可以延长到60—90分钟,但要防止过热。如果有那种温度贴,可以贴上参考温度),即使205kd这么大的蛋白转膜效率也高达80%。各种大小的蛋白的转移效率都ok。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转(面积还是按照单个计算),或者并排放(2块胶的面积计算),只要控制好单位面积的电流强度和时间,防止过热就好了。
    discontinuous blotting buffer to be used: anode buffer i: 300 mm tris anode buffer ii: 30 mm tris cathode buffer: 25 mm tris/hcl (ph 9,4)
    40 mm 6-aminocapronic acid

     

  9. 有人觉得转膜加sds有助于大分子蛋白转膜,我个人持保留意见,因为sds等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合,反而不好。

  10. 如果只做western blot,膜可以用丽春红s染色并在脱色前照相,对后面的免疫反应影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置,以免后面会洗掉而无法判断结果。预染marker也有助于判断转膜的效率和情况,如果比目标分子大的marker都已经转过去了,那就ok了。如果有能在western结果显色的marker(比如生物通前面特别推荐的别出心裁 特别好用的蛋白分子量标准 谁可小看“蛋白标准”(下) )就更方便了。

  11. 有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序,如果要蛋白测序需要提前一天倒胶,并说预电泳6小时(有还原剂如glycolate)后再倒积层胶。除了要做hplc分析应该用丽春红s而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色,其他的比如测序和或者pth都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。没条件做,参考而已。

  12. 转印后的pvdf膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带,有时这种快速的方法可以不用染色识别条带,避免染色膜影响后继实验。

    转膜后的封闭注意:

  13. 转膜后,膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方(实验太晚了还可以补充一下营养,哈哈),用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶,可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法(如果用了生物素标记的marker而且结果背景较高,分析结果也有可能是受此影响),脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测(ap)方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统,封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/l edta磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活(可以加0.05%叠氮化钠,新鲜最好)。经济的脱脂奶配方和ap兼容得不太好,再加上hrp的底物选择范围也更宽,现在hrp是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(nan3)对辣根过氮化物酶(hrp)有灭活作用,如果用hrp检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全,后面就全白忙活了。

  14. 如果选用ap作为显色方法,封闭时就要选择tris缓冲体系,不要用pbs,因为pbs干扰ap。再想起什么再补充吧。下一篇转到显色试剂的选择了。

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