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western显色篇(下辑)

发表于:2007-6-6 10:54:37    点击率:5569

   western blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是ap——碱性磷酸酶。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统——包括固定化抗原(wb)检测和核酸检测。但是做过ap实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题,所以就westernblot本身来说偏爱hrp的要比ap多——分子克隆iii解释说由于在我们常用的封闭剂:脱脂奶粉和牛血清白蛋白bsa中富含ap,这样当然显色背景会高。所以分子克隆iii推荐的ap适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo ledta 65度加热一小时确保ap失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶,虽然实验上很容易实现抑制内源ap影响,但实际上容易被忽略。ap显色底物生成的产物主要是蓝紫色,成像性好容易拍照。早些年前,ap检测的灵敏度比hrp高,但是背景也偏高,整个显色过程更有“技术性”,有许多个人技巧在里面,让人取舍两难。如今由于hrp系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高,化学发光显色上hrp和ap不相上下,但是生色反应来说,ap显色的灵敏度还是比一般的hrp显色底物要高。

    ap作为一种经典常用的显色交联酶,自有其优点,比如ap的底物显然更稳定,不像hrp那样需要新鲜配制的h2o2一类的不稳定成分,作为试剂盒可以保存时间更长,也自有一批忠实的”粉丝”(fans),特别是习惯用显色方法检测wb结果的。就像hrp可以用于化学发光和底物显色一样,ap也有这两种常用的检测方法的不同底物。ap显色的灵敏度就已经可以达到低皮克级,前提是封闭要做得好。常用的是bcip(5-bromo-4-chloro-3’-indolyphosphate p-toluidine salt) ,nbt (nitro-blue tetrazolium chloride)和int。

 

bcip

nbt

bcip/nbt

bcip/int

学名

5-bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate, toluidine salt

nitro-blue tetrazolium chloride

 

 

作用

o2反应形成沉淀

氧化反应

bcip除了可以和o2反应,也可以用nbt作为电子受体

氧化反应

灵敏度

100pg

100pg

30pg

一般

沉淀颜色

紫色

蓝紫色

蓝紫色

棕红色

用途

ap显色

ap或者葡糖氧化酶

ap,原位杂交和免疫组化

ap和免疫组化

    几乎出显色剂的厂家都会生产到这几种底物,比如roche的bcip和int/bcip ,pierce的bcip/nbt,其中以bcip/nbt灵敏度最高,显色也比较锐利,成像性比较好,因此也就最常用到。预配的即用型显色底物不存在颗粒性底物,较少产生斑点背景。neb和invitrogen也有完整的检测试剂盒。

    还有一些比较特殊的各家的“法宝”,这里要拿出来“显摆显摆”。比如pierce公司的fast red是为western印迹,点印迹和免疫组化过程中检测ap而专门设计的,这种底物产生的是亮红色沉淀,经过优化,灵敏度高,其中最有趣之处在于其双染色的好处:由于这种亮红色沉淀可以与不溶的hrp底物沉淀无论是nc还是尼龙膜上都能形成醒目的对比,因此可以进行两次显色,检测不同的蛋白。但是要注意的是fast red要比hrp底物先加,以防背景颜色加深(fast red可能有毒,小心操作哟)。

    ap的化学发光底物可以说是未来创造wb化学酶联底物灵敏度“神话”的希望所在――由于ap在催化脱磷底物方法时转换数高(转换数:每秒钟每个酶分子催化底物转变为产物的量,是酶效率的一个测量单位),可快速产生强信号,因此可以获得非常漂亮灵敏的wb结果,而且不需要像生色底物那样等待半小时才能看结果。

    invitrogen的westernbreeze就是检测灵敏度达到femto飞克级别的ap化学发光法检测试剂盒,而且发光持续时间长达5天!真可谓是ap发光显色中的“恒星”。迅速、安全,灵敏度可比同位素,兼容成像系统,再加上优化后的极低背景,westernbreeze几乎可以解决你所有的顾虑。而另一个又是来自pierce公司的产品—lumi-phos wb也是ap化学发光的代表之作,因为lumi-phos的灵敏度可以达到低pg级——1.2pg(小鼠il2为例只需要71 attomoles,10–18 mole), lumi-phos都可以帮你检测出来,另外适用这种检测方法的膜还包括尼龙膜——这是许多化学发光底物所不兼容的(尤其是ecl之类高灵敏度的检测方法),可见其信噪比是特别优化过的。lumi-phos wb的发光持续时间是8个小时(2小时内光最强)(据说现在pierce正在打特价,要赶快行动哦)。

    除了生色底物和化学发光底物,ap的荧光底物也很有特色。invitrogen的pre-q western blot stain kit,是用ap的荧光底物ddao来显色的,检测灵敏度达到2ng,堪比一般的化学发光检测试剂盒。这个荧光底物的好处在于,经过ap分解后得到的红色荧光产物是稳定的,不会因为底物用完而消退,不需要暗房或者压片,干噪后的膜上更明显,在紫外或者扫描仪上可随时检测。ap的还有一种用于荧光发光检测的ap底物—attophos substrate(promega),主要用于elisa的检测。荧光底物是不同于前两者的酶促显色系统,其最大的优势就是灵敏度(吸收值稳定为前提),这种来源于生物的显色物质不仅可以避免化学物质的毒性,而且显色时可以在低背景的前提下达到0.1 attomole显色级别。这算是体外话了。

    另外还有一种不常用的耦联酶--ß半乳糖苷酶,它的底物中有一个在克隆筛选中鼎鼎大名的化学物质:x-gal,它与ß半乳糖苷酶反应可以形成一种蓝色沉淀,因此被用于免疫杂交分析中,但是由于不如前两种酶显色灵敏和方便,所以没有这么常用到。

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