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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blotting常见问题及其对策

发表于:2007-6-6 10:55:46    点击率:6101

可能原因

建议解决方法

推荐电压条件下电泳时间过长

电泳缓冲液过稀

配制新鲜缓冲液,使用1x稀释液

推荐电压条件下电流过高,热量过大

电泳缓冲液过稀

配制新鲜缓冲液,使用1x稀释液

推荐电压条件下电流过低或无电流

接触不良

在电泳前移除胶盒底部的封条;

确认缓冲液没过加样孔;

检查buffer core上导线连接

蛋白带型条状(streak

上样过量
样品中盐浓度过高

降低蛋白上样量

通过透析或凝胶过滤降低样品中的盐浓度

样品沉淀

加大样品中sds的浓度

样品中的污染,如脂类或dna 复合物

离心或过滤样品以除去特定污染

制胶不佳

确保灌胶均匀,一次完成

条带模糊

蛋白样品部分变性

完全变性蛋白

蛋白样品部分还原

确保加入足够量的dtt或β巯基乙醇。

电泳时间过长

观察前面的指示剂染料,掌握恰当的电泳时间。

哑铃形条带或

“微笑”条带

上样体积过大导致不完全堆积

使用恰当的上样体积,

如果样品过稀,使用超滤浓缩

电泳过程中电场不均匀

如果蛋白浓度已知,上样时确保对称。

分离胶表面不平

在制胶时使分离胶表面水平。

凝胶过期

在指定的失效期前使用凝胶。

   题

出现的原因

解决方法

1. 胶片上存在反转印象 (:亮的条带.黑的背景)

hrp的浓度过高

稀释hrp至少10

2. 膜上有黄色或棕色的沉积

hrp的浓度过高

稀释hrp至少10

3. 在暗室中条带过于明亮

hrp的浓度过高

稀释hrp至少10

4. 条带的发光时间持续了至 8小时

hrp的浓度过高

稀释hrp至少10

5. 信号太弱或没有

1.太多的hrp积聚导致信号快速的消退
2.
抗原或抗体的浓度不够
3.
转印不成功
4.hrp
或其他底物的效价降低

1.稀释hrp至少10

2.
增加其浓度
3.
寻找合适的转移方法和条件
4.
选择其他的合适底物

6. 高背景

1.hrp浓度过高
2.
封闭无效
3.
不适合的封闭试剂
4.
洗涤不充分和洗涤液的量
5.
胶片曝光过度
6.
抗原或抗体的浓度太高

1.稀释hrp至少10
2.
寻找合适的封闭方法
3.
选用其他的封闭试剂
4.
增加洗涤的时间,次数
5.
减少曝光时间
6.
稀释抗原或抗体

7. 蛋白质条带上 有空泡影像

1.蛋白质没有被充分转印
2.
膜没有预先浸湿
3.
在胶片和膜之间有气泡

1.寻找合适的转移方法和条件
2.
在转印前充分浸湿
3.
在暴光之前赶走气泡

8. 胶片上背景弥散

hrp标记的抗体出现了积聚

0.2μl的滤膜过滤hrp标记的抗体

9. 无特异性条带

1.hrp浓度过高
2.sds
促使非特异蛋白质条带黏附在目的蛋白质条带上

1.稀释hrp至少10
2.
在操作过程中不要加sds

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