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蛋白质印迹

Western Blot 疑难解答

发表于:2007-6-6 10:56:02    点击率:6053

cst抗体 western blot 疑难解答

problem:高背景(曝光1-30秒后,背景高或无特异性蛋白带)

cause:一抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度

 solution:使用推荐的阻断剂和tbs/t稀释抗体并4℃孵育过夜。多克隆抗体使用5%的bsa;单克隆抗体使用5%的脱脂奶粉

cause:化学发光检测时没有使用相应的膜

solution:使用高质量的nitrocellulose或pvdf膜

cause:膜阻断不足导致一抗或二抗产生大量的非特异性结合

solution:用含5%脱脂奶粉的tbs/t在室温阻断1小时(不能超过一个小时)

cause:二抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度,或二抗的特异性差

solution:一些二抗会与蛋白产生非特异性的结合。因此在检测中可加入一步二抗的对照试验,在没有一抗的情况下,直接加入二抗孵育。也可将二抗用含5%脱脂奶粉的tbs/t在室温下孵育1小时

cause:配制试剂的用水水质不佳

solution:在配制试剂时(尤其是磷酸化抗体)使用milli-q或其它超纯的去离子水

 


problem
:信号弱(1-30秒的曝光后检测不到信号)

cause:一抗孵育不足

solution:适当延长孵育时间(4℃孵育过夜)

cause:转膜不完全

solution:转膜时采用更高的电压和更长的时间。也可采用预染的蛋白marker监控转膜的过程

cause:阻断膜超时

solution:阻断膜的时间不能超过1小时

cause:蛋白的表达水平低于检测底限

solution:在每孔中加入更多的蛋白;先采用免疫沉淀法富集蛋白;换用表达高的样本或细胞;检测前适当刺激蛋白的表达

cause:二抗与一抗的结合率太低

solution:提高二抗的浓度或换用与一抗匹配的二抗

cause:配制试剂时发生交叉污染

solution:重新配制各种试剂


cst
免疫组化 疑难解答


problem
:无着色

cause:组织切片的质量不好或固定不足

solution:更换好的组织切片

cause:底物反应时间太短

solution:延长底物反应时间,直至出现着色

cause:不合适的一抗或二抗

solution:更换一抗或二抗

cause:没有执行抗原修复

solution:执行抗原修复

cause:试剂的配制不正确

solution:重新配制试剂

cause:蛋白表达太低

solution:加入对照试验


problem
:着色太浅

应时间太短

solution:延cause:底物反长底物反应时间

cause:一抗的浓度太低或孵育不足

solution:提高一抗的浓度(1:50;1:100

cause:蛋白表达太低

solution:加入对照试验

 

problem:着色太深

cause:底物反应时间太长

solution:减少底物反应时间

cause:一抗或二抗的浓度太高

solution:降低一抗或二抗的浓度2-3

cause:切片的质量不好

solution:选用质量好的组织切片

cause:组织切片没有进行阻断

solution:用含5%血清的阻断液阻断1小时

cause:冲洗不完全

solution:每次冲洗时间不低于5分钟

cause:二抗与样本发生交叉反应

solution:选用合适的二抗


problem
:不正确的染色

cause:底物反应时间太长

solution:减少底物反应时间

cause:一抗或二抗的浓度太高

solution:降低一抗或二抗的浓度2-3

cause:阻断不足

solution:延长阻断时间或提高血清浓度

cause:切片的质量不好

solution:选用质量好的组织切片

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